Forskere kan følge virusinfektioner i zebrafisk med technolys

I skrivende stund er de første corona-vacciner lige taget i anvendelse. Forskere over hele verden har været og er i gang med at udvikle effektive vacciner og kontrolmetoder overfor coronavirussen.

For at kunne udvikle vacciner imod virusser helt generelt, er det vigtigt at kende virussernes basale biologi. Derfor prøver forskere kontinuerligt at undersøge og kortlægge dette, så man opnår en bedre forståelse af de biologiske mekanismer og på den måde kan prøve at udvikle kontrolstrategier.

Viruspartikler er jo så små, at man ikke kan se dem med det blotte øje, og derfor bruger man specialiserede teknikker til at opdage og følge virus.

Virus findes i alle dyr såvel mennesker som andre pattedyr, krybdyr, padder, fugle, fisk, hvirvelløse dyr og bakterier.

En virus fra fisk er nu blevet genmodificeret, så de celler, den inficerer, begynder at udsende rød fluorescens. Og det er her, vores historie starter.

Tænk, hvis man blot ved at kigge ned i et mikroskop kunne se, hvordan en virus spreder sig? Det er faktisk lige præcis det, som vi kan med den genmodificerede fiskevirus.

Ved at inficere zebrafiskelarver og lægge dem under mikroskopet kan vi følge spredningen af virus rundt i kroppen, og vi kan oven i købet se, hvilke slags celler den inficerer, og hvorledes celler fra immunsystemet reagerer imod virussen.

Før vi når dertil, vil vi først fremhæve fordelene og perspektiverne ved forsøgsdyr i det hele taget og zebrafisk som forsøgsdyr i særdeleshed.

Derfor er forsøgsdyr så vigtige

Zebrafisken er blevet en meget populær 'modelorganisme' (læs: et godt forsøgsdyr) til at undersøge alt fra immunforsvarets reaktion imod bakterier, virus og parasitter (se her og her) til kræft, aldring og Alzheimers.

Den har været populær siden slutning af 1980'erne og er med tiden blevet en bedre model, da stadig flere mekanismer i fisken bliver klarlagt.

En modelorganisme bruges som repræsentant for andre organismer, der ofte minder om modelorganismen.

Man kan dermed køre forsøg i 'modellen', som er mere besværlige og omkostningsfulde eller umulige at køre i den organisme, man egentligt er interesseret i.

For eksempel køres kræftstudier, hvor kræft fremkaldes, jo ikke i mennesker men i eksempelvis mus.

Hvorfor overhovedet bruge zebrafisk?

Der er mange fordele ved at arbejde med zebrafisk som model. For det første er genomet kortlagt.

For det andet er den nem at avle, producerer et højt antal afkom, og hele zebrafiskens livscyklus tager kun tre måneder – det betyder kort ventetid og et godt statisktisk materiale for os forskere.

Derudover kan man have mange fisk på et lille areal, hvilket hjælper på de økonomiske omkostninger der er ved at have forsøgsdyr.

Zebrafisken er derudover fuldstændig gennemsigtig i starten af dens udvikling, hvilket muliggør visuel dokumentation af processer inden i fisken, mens den er i live.

Der findes nu så mange transgene zebrafiskelinjer, at værktøjskassen for, for eksempel, immunologiske studier er blevet meget stor.

'Transgen' vil sige, at man ændrer på zebrafiskens arvemasse ved at indsætte gener fra mennesker eller andre dyr.

Og sidst men ikke mindst kan man holde fiskene ved temperaturer, der spænder fra 6-38 grader Celsius, herunder de 37 grader, der er relevante, når man gerne vil sammenligne med mennesker.

Hvilke celler foretrækker virussen?

Når en virus inficerer en organisme, er det vigtigt at vide, hvilke celler virussen foretrækker, hvis man skal udvikle et middel til at dæmme op for den.

Vores fiskevirus er kendt for at inficere endothelceller i andre fisk – det er de celler, som danner det inderste lag af blodårerne.

I og med at vi har en genmodificeret virus, der får inficerede celler til at udsende rød fluorescens, kan vi direkte se, om virussen også foretrækker endothelceller i zebrafisken.

Virussen bærer en sekvens for et protein, der kaldes 'Tomato', som bliver udtrykt i den inficerede celle, og som udsender rød fluorescens, når cellerne belyses med 594 nm lysbølger.

Og for at gøre det endnu lettere har vi brugt en transgen linje af zebrafisk, hvor endothelcellerne i hele blodåresystemet lyser med grøn fluorescens (se figur 1), når fisken belyses med en bestemt bølgelængde lys (488 nm).

Med fluorescenslys kan vi følge virussens gang

Efter at have inficeret fiskene, som foregik ved, at vi mikroinjicerede virus i to dage gamle larver i blommesækken, fik virus lov til at sprede i fiskene i et par dage.

Dernæst indstøbte vi larverne i en gel, hvor de var bedøvede, for at få dem til at ligge fuldstændigt stille, så de kunne undersøges, mens de var i live.

Denne gel med fisk undersøgte vi derpå i et konfokalmikroskop. I mikroskopet er det muligt for os både at se almindeligt hvidt lys samt grønt og rødt fluorescenslys på en gang (se figur 2).

Det vil altså sige at, vi kan følge infektionsprocessen i fisken, imens den er i live. Vi kan endda optage processerne på video, så man kan se præcis, hvordan virus spreder sig.

Derved opnår vi et billede af hvorledes virus spreder sig og får en indikation af, hvilke celler virussen foretrækker at inficere.

Vi kan se at en gul/orange farve opstår, som jo er en blanding af grøn og rød, hvilket vil sige, at endothelcellerne i en overgang både udsender grøn og rød fluorescens, hvorefter det grønne lys 'slukker', og det røde tager over, indtil cellen dør på grund af virusinfektionen.

På figur 3 ses et closeup, hvor man tydeligt kan se, at det røde lys primært findes i blodårerne.

Ud over at følge infektionsspredningen og se hvilke celler, der bliver inficeret, kan vi også, ved at bruge en anden transgen-linje med fluorescerende immunceller, se hvorledes disse celler opfører sig ved virusangrebet (se video herunder).

På videoen ses et område nær halen på en zebrafiskelarve, hvor rød farve viser, hvor virus har inficeret, og hvor de grønne celler er hvide blodlegemer (af typen neutrofiler), der patruljerer i området. Videoen er optaget henover en time og afspilles med forøget hastighed. (Video: Forfatterne)

Kan man sammenligne zebrafisk med mennesker?

Der er store forskelle på zebrafisk og mennesker, så kan man overhovedet bruge forsøg i zebrafisk til at sige noget om mennesker? Som ethvert andet forsøgsdyr har forsøg med zebrafisk sine begrænsninger.

Desto mere et forsøgsdyr ligner mennesket, desto bedre kan vi overføre resultaterne. For det er selvfølgeligt vigtigt at vide, om hvad der gælder i zebrafisk, mus, rotter, menneskeaber osv., også gælder i mennesker.

I forhold til zebrafisk og mennesker er immunsystemet faktisk basalt set bygget op på samme måde.

Immunresponset er blandt andet blevet undersøgt i zebrafisk, der er blevet inficeret med den humane Influenza A virus. Der har forskere vist, at influenzaen i zebrafiskene kunne slås ned med et almindelig influenzamedikament (Zanamivir).

På den måde kan man teste og screene medikamenter på zebrafisk og blive klogere på, hvorledes værtens immunsystem reagerer overfor virussen.

Der findes tusindvis af transgene zebrafiskelinjer, som gør det muligt at undersøge meget forskelligt. For eksempel findes der linjer, hvor forskellige hvide blodlegemer er fluorescerende, og hvor receptorer eller cytokiner udsender fluorescens.

Derved kan man for eksempel undersøge immuncellers reaktioner og dræberevner på forskellige patogener, eller man kan undersøge, hvilke receptorer specifikke stoffer aktiverer.

Der findes også linjer, hvor neuroner eller hjertestrukturer er fluorescerende, således at vi kan se følge udviklingen af disse strukturer kan følges under såvel sygdom som behandling.

Hvis ikke den ønskede genmodificerede linje findes, kan den muligvis laves eksempelvis ved hjælp af den nye CRISPR/Cas teknik.

Zebrafisk kan teste behandlinger

Ved virus-, bakterie- eller parasitinfektioner i zebrafisk er det relativt let at teste og screene (visse) behandlinger.

Man kan enten sprøjte stofferne ind i fisken eller bade fiskene i medicinen, hvorved det bliver optaget over huden og gællerne.

Derefter skal man aflæse om sygdommen er uændret, om den bliver værre eller om den bliver bedre. Sådanne tests er langt nemmere og hurtigere at udføre i zebrafisk end i den mest brugte dyremodel, nemlig mus.

Og med eksempelvis en fluorescerende virus eller bakterie vil man hurtig kunne se, om 'fjenden' er i fremgang eller på retræte.

Forskere bruger allerede zebrafisken som model for behandlinger imod coronavirus for at teste sikkerheden og immunresponset i et hvirveldyr imod SARS-CoV-2 virus.

Dog vil nogle nok hævde, at eftersom zebrafisk ikke har lunger men gæller, er det ikke den bedste model at bruge.

Men der er mange aspekter i forskningen og man ville fint kunne studere om og hvordan og ved hjælp af hvilke mekanismer coronavirussen invaderer celletyper, som er fælles for både zebrafisk og mennesker – eksempelvis endothelceller, neutrofiler og makrofager.

Zebrafisken repræsenterer altså et utroligt anvendeligt værktøj, når der skal forskes i sygdomme og behandlinger – og så kan man få et helt unikt 'live' billede/video af, hvad der sker imellem værten og patogenet, mens kampen står på.

Og det er nok hovedsageligt det sidst nævnte aspekt, der gør, at zebrafisken har indtaget en stor del af verdenskortet, da der ikke findes noget andet hvirveldyr, hvor vi kan se og filme processer og interaktionerne indeni dyret, mens de står på, med sådan en lethed.

Det har og vil i fremtiden bidrage signifikant til videnskaben. Det, man kan se med egne øjne, tror man på.

Vi har modtaget støtte til vores forskning i zebrafisk fra Kirsten og Freddy Johansens Fond.

I denne video kan du lære mere om zebrafisken, og hvorfor den er så vigtig for forskningen: