Hvordan fungerer nanoskopi egentlig?

Den seneste nobelpris i kemi blev tildelt tre forskere for udviklingen af superopløsningsmikroskopi; Stefan W. Hell, William E. Moerner og Erik Betzig.

Forskerne har tilsammen videreudviklet det traditionelle mikroskop til et såkaldt nanoskop, som kan bruges til at observere levende organismers strukturer på ganske få nanometer.

Videnskab.dk dækkede begivenheden, og flere forskere har siden tilkendegivet, at det var velfortjent, at de tre forskere modtog nobelprisen.

Nanoskopet har brudt grænserne

Men hvis man nu ikke er kemiker, kan det være svært at forstå, hvordan teknikken bag det nye supermikroskop egentlig fungerer.

Derfor har Videnskab.dk allieret sig med postdoc Mathias P. Clausen fra University of Oxford, der til dagligt benytter nanoskopet til at observere cellemembraner. Hans arbejde og forskning er afhængigt af det nye mikroskop, og uden det ville han ikke kunne observere membranernes struktur i detaljer.

»Tidligere var der en grænse for, hvor små strukturer man kunne skelne med et traditionelt mikroskop. Men med nanoskopet har vi brudt grænsen for, hvor små strukturer vi kan opløse og dermed observere,« siger han.

For at forstå den betydelige forskel mellem det traditionelle mikroskop og superopløsnings-nanoskopet, kan du bladre i galleriet øverst i artiklen og se billeder, der er taget med det traditionelle og det nye nanoskop.

Nu kan vi se strukturer helt ned på én nanometer

Problemet med det traditionelle mikroskop er, at man ikke kan se organismers strukturer. Mikroskopet fungerer ved, at man ofte bruger blåt lys til at skanne prøver. Årsagen er, at det har den mindste bølgelængde på cirka 475 nanometer.

Da man kun kan opløse strukturer, der er halvdelen af lysets bølgelængde, betyder det, at det er umuligt at observere strukturer, der mindre end 200 nanometer med et traditionelt lysmikroskop.

Men nu er der nærmest ingen grænser for, hvor små strukturer man kan observere. Udviklingen af nanoskopet, sammen med særlige farvestoffer som oplyses, når de aktiveres af mikroskopets laser, gør tilsammen, at man kan se strukturernes detaljer.

»Nu er vores eneste begrænsning den 'baggrundsstøj', som er i vores prøver. Der kan være ting, som gør, at opløsningen ikke er så god, som vi håber på. Men for at man skal kan se små størrelser, skal man have et kraftigt signal. Derfor har man sammen med nanoskopet udviklet særlige fluorescerende farvestoffer, som sender nok signal til, at man kan se enkelte kopier af dem. Under ekstreme forhold kan vi se strukturer helt ned til 1 nanometer. Men vi kan ikke se ting, der er mindre end molekylerne selv, og de har en størrelse på en nanometer,« siger Mathias P. Clausen.

Blinkende farvestoffer giver detaljerede billeder

Egentlig var det ikke et enkelt nanoskop, de tre nobelprisvindere udviklede. Forskerne udviklede to forskellige typer superopløsningsmikroskopi, der hver har forskellige teknikker, som gør billederne af de små strukturer ultraskarpe.

Det ene nanoskopi, kaldet lokalisations-nanoskopi eller PALM (Photoactivated localisation microscopy), blev udviklet af amerikaneren Erik Betzig. Ved denne form for nanoskopi mærker man sin prøve med flouroserende proteiner, som lyser op, når de aktiveres af en laser.

Normalt ville man aktivere alle farvestofferne på én gang for at se alle strukturerne i organismen. Men Erik Betzig fandt ud af, at der var en smartere måde at gøre det på.

»I stedet for at tænde alle farvestofferne på én gang, kan man få dem til at være tændt skiftevis. Vi tager en lang række billeder, måske 10.000 billeder, hvor der på hvert billede kun er et vist antal aktiverede lysende farvestoffer. Hvert enkelt billede vil derfor forestille en masse lysende prikker. Herefter kan vi gå ind og finde hver lysende priks centrum og markere det. Til sidst lægger vi alle billederne sammen og får et detaljeret billede af organismens struktur,« forklarer Mathias P. Clausen.

Laser er formet som en donut

Den anden type nanoskopi, kaldet STED (stimulated emission depletion), er udviklet af tyskeren Stefan Hell. Her tager man også udgangspunkt i at aktivere farvestofferne skiftevis, men man gør det med en anden form for laser.

»Man belyser sin prøve med to forskellige lasere; den traditionelle laser og en STED-laser. Den første tænder for farvestofferne, mens den anden slukker for dem, inden de når at udsende lys. Umiddelbart lyder det som om, man ikke kommer langt med denne strategi. Men hvis man former STED-laseren som en donut om den originale laserstråle, vil farvestoffernes signal kun blive slukket i donut-ringen, men ikke i laserens centrum,« siger Mathias P. Clausen.

Herefter skanner man prøven med begge lasere samtidig. Har man to farvestoffer, der ligger tæt på hinanden, vil farvestofferne først møde donut-laseren og dermed blive slukket. Derfor kan man skelne farvestoffer, der ligger utrolig tæt på hinanden, fra hinanden.

»Det er en fysisk umulighed at gøre det belyste område skarpere eller mindre uden brug af donut-funktion. Man kan nemlig ikke fokusere lyset på sin prøve til et uendeligt lille punkt. Grænsen for, hvad man kan fokusere ned til, er halvdelen af lysets bølgelængde, altså cirka 200 nanometer. Men med den nye teknologi bryder vi den grænse,« siger Mathias P. Clausen.

Nyt mikroskop kan få stor betydning for neurologien

Umiddelbart lyder det meget smart, at forskere kan observere bittesmå strukturer i detaljer. Men hvad skal vi så bruge teknologien til i praksis?

Ifølge Mathias P. Clausen kan man med det nye supermikroskop genoverveje alle de billeder, man tidligere har taget af små organismer.

»Det er et helt nyt område, som man kan udforske, og særligt biologi, der foregår på nanometerskala, kan vi nu blive endnu klogere på,« siger han.

Også inden for neurologien kan udviklingen af mikroskopet få stor betydning.

»Nu kan man skanne musehjerner og se, hvordan hjernens celler opfører sig under høj opløsning. Man kan se, hvordan hjernens celler signalerer til hinanden,« siger Mathias P. Clausen og fremhæver også sit eget forskningsområde, nemlig observationen af cellemembraner, som et forskningsområde hvor nanoskopet har haft en kolossal betydning.

Klogere på kommunikationen mellem celler

Cellemembranen er den første barriere, man møder i en celle. Ifølge Mathias P. Clausen har man brugt nanoskopet til at finde ud af, hvad der foregår i membranen, hvilket er vigtigt, hvis man vil undersøge, hvordan cellerne kommunikerer med andre celler.

»De proteiner og fedtstoffer, der er i membranen, har vi haft en formodning om, organiserer sig i nogle bestemte områder, men vi har ikke kunnet se det, fordi vi ikke har haft opløsningen til det. Med nanoskopet har vi fundet ud af, hvilke principper der gælder for, hvordan molekylerne er ordnet i membranen. Det har vi ikke kunne se tidligere,« siger han og fortsætter:

»Den viden kan vi bruge til at se, hvordan celler i immunforsvaret signalerer til hinanden. Hvis der kommer en uidentificeret organisme ind i kroppen, skal cellerne vurdere, om det er en trussel eller ej. De skal kunne kende kroppens eget stof frem for andre. Derfor signalerer de til hinanden, når organismen skal fjernes, og der tror vi, at organiseringen i cellemembranen har en stor betydning for, om de rigtige molekyler mødes på det rigtige tidspunkt,« siger han.

Her ses de tre vindere af Nobelprisen i kemi 2014. Fra venstre: Stefan W. Hell, William E. Moerner og Erik Betzig. (Foto: Wikimedia Commons/K. Lowder via Wikimedia Commons/Matt Staley/HHMI)

Eric Betzig har taget dette billede af en Escherichia coli bakterie, for at forstå, hvordan organiserer tre typer proteiner i dens membran. Sammen med William Moerner udviklede de PALM-mikroskopiet. (Foto: LBNL/SPL)

Et tredimensionalt billede af en af cellens cytoskelets vigtigste komponenter, mikrotubulus. Billedet er taget ved brug af PALM-teknikken. (Foto: Jim and Cathy Galbraith, Gleb Shtengel, Harald Hess/HHMI/Janelia Research Campus)

En prøve fra en hjernetumor. Til venstre ses billedet taget emd et traditionelt mikroskop, og til højre ser man samme prøve, taget med et STED-mikroskop. (Foto: J. Bückers, D. Wildanger, L. Kastrup, R. Medda/Max Planck Inst. for Biophysical Chemistry)

Med udviklingen af nanoskopet, har andre forsøgt at videreudvikle mikroskopet med samme principper. Dette billede er taget med den såkaldte STORM-teknik, som ikke blev belønnet med en nobelpris. (Foto: Xiaowei Zhuang Lab/HHMI/Harvard Univ)

Dette billede er også blevet til med STORM-teknikken, der altså ikke blev belønnet med en nobelpris. Billedet forestiller en mitokondrie, der er cellens 'kraftværk'. (Foto: Xiaowei Zhuang Lab/HHMI/Harvard Univ)

Et andet videreudviklet nanoskop, som går under betegnelsen SIM, blev heller ikke tilddelt en nobelpris. Dette billede forestiller en kræftcelle. (Foto: Derek Toomre, Yale Univ./2013 GE Healthcare Life Sciences Cell Imaging Competition)

1 / 7