Historien om CRISPR: Nyuddannet forsker stjal opdagelsen fra bakterier

Hvert år op til uddelingen af Nobelpriserne har forskere og eksperter de seneste år udråbt CRISPR som det sikreste bud på en vinder.

På ganske få år har CRISPR-teknologien nemlig revolutioneret alt fra planteforskning til udviklingen af ny medicin.

»Nobelprisen kommer uden tvivl, det er kun et spørgsmål om tid,« siger mikrobiolog og professor ved DTU Egon Bech Hansen.

I 2007 var han forskningschef i den danske fødevareindustris stolthed, Danisco, hvor et forskerhold opdagede CRISPR som et system, bakterier bruger til at skære DNA fra invaderende virus i småstykker.

I dag hører vi mest om de molekylærbiologer, der efterfølgende tog opdagelsen og forvandlede den til den gen-saks, som har revolutioneret store dele af biologien og endda åbnet døren til at redigere i menneskets arvemateriale.

Til sammenligning har de forskere, som faktisk opdagede CRISPR-systemet og lagde grunden for CRISPR-revolutionen, været overset.

Det her er historien om, hvordan CRISPR begyndte med studiet af små mælkesyrebakterier.

Mælkesyrebakteriernes hemmelige våben mod virus

CRISPR er i virkeligheden en opfindelse, som vi har tyvstjålet fra bakterierne, og i det perspektiv begynder historien for umanerligt lang tid siden.

Bakterier har levet på planeten i milliarder af år og siden tidernes morgen kæmpet en nådesløs evolutionær kamp mod virus kaldet bakteriophager (dem, der æder bakterier) eller blot phager.

Usynlige horder af phager bombarderer konstant bakterierne, så det har været livsnødvendigt at have nogle forsvarstricks oppe i ærmet - og CRISPR er bakteriernes geniale immunforsvar mod virus.'

Du kan læse mere om bakteriophager i artiklen Bakterier skruer op og ned for deres immunforsvar.

2005: Molekylærbiologen Philippe Horvaths opdagelse

Det vidste ingen dog før en dag i begyndelsen af 2005, hvor molekylærbiologen Philippe Horvath spærrede øjnene helt op.

På sin computerskærm så han en kromosom-analyse af mælkesyrebakteriens arvemateriale, som afslørede stumper af nyligt integreret virus-DNA i bakteriens arvemateriale.

»Det var Eureka!-øjeblikket (et græsk udtryk, der betyder: ’Jeg har fundet’ og bruges som udråbsord for at fejre en opdagelse, red.),« siger Philippe Horvath, der dengang som nu forskede i mælkesyrebakterier på et laboratorium, DuPont Nutrition & Health, i den lille by Dangé-Saint-Romain et par timer fra Paris.

Men inden vi hører, hvorfor de virus-DNA stykker fik hans kæbe til at ramme gulvet, skal vi lige have lidt mere af baggrundshistorien.

Phager ødelægger mælk for millioner

Mælkesyrebakterien Streptococcus thermophilus er populært sagt mejeriindustriens arbejdshest.

»Det er den vigtigste bakterie i yoghurt-produktion, og den fermenterer også mælk til ost som emmentaler, mozzarella og mange flere,« siger Horvath.

Men ligesom alle andre bakterier er den udsat for phag-angreb, som forårsager kæmpe økonomiske tab.

»Når et syrningskar bliver inficeret med virus, går syrningen i stå og bliver noget halvtyndt pjask, og flere tons mælk må kasseres,« forklarer Egon Bech Hansen.

Derfor er der et konstant behov for at starte produktioner op igen med friske kulturer af S. thermophilus-mælkesyrebakterier, og derfor har mejerierne længe arbejdet på at indsamle og karakterisere både phager og bakteriestammer, som var blevet resistente.

Det var her, Philippe Horvath kom ind i historien.

Horvath skulle finde en løsning

Som nyuddannet ph.d. i molekylærbiologi blev han ansat i laboratoriet i Dangé-Saint-Romain til at udvikle molekylære metoder for at skelne bakteriestammer fra hinanden.

Det var dengang, firmaet hed Rhodia Food, inden det blev opkøbt af Danisco i 2004, der igen blev købt af det amerikanske DuPont i 2011, som i 2017 fusionerede med Dow til DowDuPont.

Nok om ejerforholdene, det vigtige er, at Horvath skulle finde en måde at identificere bakterier ved at bruge deres arvemateriale (DNA), så industrien kunne forny kulturerne med de rigtige bakteriestammer efter phag-angreb.

I 2002 så han en poster på en konference i Holland, som i virkeligheden blev begyndelsen til det hele.

Gådefulde klynger som ID-papirer

På posteren skrev en gruppe forskere, at de havde fundet nogle sære klynger af DNA-sekvenser i S. thermophilus' arvemateriale, og de kunne bruges til »at skelne bakteriestammer fra hinanden.«

Forskerne kaldte klyngerne SPIDR, men andre forskere brugte betegnelsen CRISPR.

Den slags klynger var faktisk allerede beskrevet i 1987 som sekvenser på under 50 DNA-bogstaver, der blev gentaget med korte mellemrum, men hidtil anede ingen, hvad de var.

Horvaths nysgerrighed var vakt: Hvis DNA-stykkerne mellem de repeterede klynger var et særkende for hver bakteriestamme, kunne det lige præcis være det, han skulle bruge.

Det skulle vise sig at holde stik, men hvad mere var - da Horvath selv kortlagde CRISPR fra S. thermophilus, så han pludselig små, nedbrudte stumper af phag-DNA gemme sig mellem CRISPR-klyngerne.

Det lignede først en gåde, men Horvath spottede også en anden ting, som fik det hele til at give mening.

På sporet af et ukendt immunforsvar

Dengang havde man i årevis fremstillet phag-resistente bakteriestammer ved at udsætte S. thermophilus-mælkesyrebakterierne for forskellige kendte phager og derefter høste de få bakterier, som overlevede.

Dem kaldte forskerne BIM (Bacteriophage Insensitive Mutant), og ved at kende hver BIM’s skabelseshistorie kunne Horvath nu se, hvordan phag-stumperne i hver BIM’s CRISPR-region direkte stemte overens med resistensen.

Det kunne ikke være en tilfældighed - phag-DNA'et måtte på en eller anden måde være blevet indlejret i bakteriens DNA og derved have gjort den immun.

Han vidste med det samme, at det var en stor opdagelse, da den slags avancerede immunforsvar, som kan tilpasse sig nye fjender hidtil kun var kendt hos højere flercellede organismer.

Det er f.eks. grundlaget for vores vacciner, og Horvath indså, at man stod med en potentiel vaccine af bakterier mod phagerne.

Det kunne blive en milliardforretning.

Uret tikkede

I starten af 2005 ansøgte Danisco om de første patenter, og så skulle det gå stærkt.

»Uret tikkede, fordi man har et år til at komme med flere eksempler (for at få patenterne, red.),« siger Philippe Horvath.

Han og forskerne havde brug for hjælp og søgte over Atlanten til en ven og samarbejdspartner, mikrobiologen og professor Sylvain Moineau ved Université Laval i Québec, Canada.

Han er ekspert i phager, og tilfældet ville, at han netop på den tid prøvede at finde svar på, hvordan i alverden mælkesyrebakterierne udviklede resistens.

»Vi havde opnået en god forståelse af bakteriernes forsvarsmekanismer, men kunne ikke forklare, hvordan bakterierne blev resistente,« siger Sylvain Moineau.

Nu fortalte Horvath og kolleger om, hvordan CRISPR så ud til at være løsningen på gåden.

Moineau var straks fyr og flamme, og med hans ekspertise i phager kunne de hurtigt sætte den serie eksperimenter op, som endte med at vise, hvad CRISPR og de phag-stumper faktisk betød.

Eksperimenter viser, hvordan CRISPR virker

En anden hovedperson i den tidlige CRISPR-historie var Rodolphe Barrangou, der blev ansat i februar 2005 i det daværende Danisco's laboratorier i Madison Wisconsin, USA, hvor han udførte mange af eksperimenterne.

De 'opdrættede' bl.a. nye resistente BIM’s og så, hvordan bakteriestammerne ligeså nydeligt fik tilført stykker af phag-DNA i CRISPR-regionen.

De lavede også BIM’s 'kunstigt' ved at gensplejse phag-DNA ind i CRISPR-regionen, og derefter bekræftede de, at resistensen blev tabt igen ved at splejse phag-DNA'et ud.

»Mit yndlingseksperiment var et, hvor vi tog to resistente bakteriestammer og byttede CRISPR-regionen om og så viste, at resistensen flyttede med. Det gav os et direkte bevis for forbindelsen,« siger Rodolphe Barrangou, der arbejder som lektor ved CRISPR Lab, North Carolina State University.

Alt i alt stod det klart, at CRISPR var et hidtil ukendt immunforsvar, hvor overlevende bakterier efter et phag-angreb indarbejdede en slags fingeraftryk fra phag'erne direkte i deres DNA.

Hvis bakterierne senere blev angrebet af phagerne, kunne de straks bruge fingeraftrykket til at genkende fjenden og mobilisere et modforsvar.

Først en lille CRISPR-revolution

Patenterne kom i hus sommeren 2006, og i marts 2007 offentliggjorde forskerne deres banebrydende resultater i det højt ansete videnskabelige tidsskrift Science.

»Det skabte en lille revolution i mikrobiologien, vil jeg sige, fordi det var et helt nyt immunforsvar mod phager,« siger Horvath.

Ingen anede, at det 5 år senere skulle vokse til en kæmpe revolution af biologien generelt.

I første omgang kastede begejstrede mikrobiologer sig over at udforske det spændende nye immunforsvar og opklare, hvilke gener der var involveret, og hvordan forsvarssystemet præcist virkede.

En af dem var professor Virginijus Siksnys i Litauen, der skrev til Horvath allerede 2 dage efter Science-artiklen om at begynde et samarbejde.

Det førte til mange artikler og var med til at rulle hele CRISPR-revolutionen ud.

Blandt de molekylære detaljer opklarede Moineaus hold, at DNA bliver skåret meget præcist af enzymet Cas9, og Siksnys hold viste, at hele systemet til at skære phagers DNA i småstykker kunne samles i én DNA-pakke og gives til helt andre bakterier.

»Det åbnede døren for at overføre hele systemet til andre levende organismer,« siger Philippe Horvath.

Så den store CRISPR-revolution

Men den skelsættende opdagelse kom i 2012, hvor to hold forskere næsten samtidig viste, hvordan man på enkelt vis kan omprogrammere Cas9-saksen til at klippe lige præcis det DNA, man ønsker, og ikke bare phag-DNA.

Siksnys' og Horvaths hold udgav en artikel i tidsskriftet PNAS, der kom lige bagefter en artikel i Science af Jennifer Doudna ved University of California, Berkeley, samt Emmanuelle Charpentier, direktør for Max Planck Instituttet i Berlin.

Med Science-artiklen overtog Doudna og Charpentier i høj grad CRISPR-scenen, og de arbejdede målrettet på at forvandle CRISPR til et gen-redigeringsværktøj i skarp konkurrence med andre forskere som Feng Zhang ved MIT, USA.

»Så var det lige pludselig ikke saksen til at klippe virus i stykker, der var i fokus, men saksen til at være skrædder i generne, som blev det drivende,« siger Egon Bech Hansen.

CRISPR har revolutioneret verden

Nu var der sat ild til lunten, og CRISPR-revolutionen eksploderede.

»De seneste 5 år har været et CRISPR-vanvid, og de her redskaber, som er så lette og hurtige, at alle kan bruge dem, har ændret livet for forskere i mange forskellige felter,« siger Rodolphe Barrangou.

»Og det er ikke bare videnskaben - det er helt ubegribeligt vidtrækkende for samfundet og vil få betydning for forretningsverdenen, forbrugere, patienter, etikere, regulering og offentligheden.«

Store priser er regnet ned over Doudna og Charpentier, men på det seneste er også de forskere, der faktisk først beskrev CRISPR, som Horvath, Barrangou, Moineau og Siksnys, begyndt at blive anerkendt med store priser.

Hvem skal have Nobelprisen for CRISPR?

Ligesom alle andre er Philippe Horvath, Rodolphe Barrangou og Sylvain Moineau overbeviste om, at CRISPR før eller siden vil vinde den ultimative videnskabelige hæder, Nobelprisen.

Men ingen af dem føler sig tilpasse ved at sætte navne på, hvem, de synes, vinderne bør være.

»Det er ikke let, sådan som videnskaben har udviklet sig - i dag er det aldrig kun 2 eller 3 personer, som står bag, så Nobelpriserne bliver ofte meget kontroversielle. Det er altid vanskeligt, og det bliver CRISPR også,« siger Philippe Horvath.

»Der er et hav af gode folk, og jeg tænker, at det enten bliver til dem, der finder begyndelsen og åbner feltet, eller dem senere, der faktisk tager CRISPR i brug,« siger Egon Bech Hansen.

Den formulering kan oversættes til, at CRISPR enten vinder kemiprisen for den grundlæggende opdagelse eller medicinprisen for at bane vejen til en ny behandling.

»Jeg krydser fingre for Philippe, Rodolphe og Sylvain, der åbnede feltet,« siger Egon Bech Hansen.