I en artikel tidligere på ugen introducerede vi fænomenet krydsreaktivitet inden for modgifte: At én modgift virker mod gift fra flere forskellige slangearter, nogle gange endda også arter, der slet ikke har været en del af produktionen.

I denne artikel forklarer vi videnskaben bag.

Modgifte, der virker

Et eksempel på en krydsreaktiv modgift er modgiften EchiTAbG fra MicroPharm, som bliver produceret i England ved hjælp af gift fra den vestafrikanske tæppehugorm (Echis ocellatus – se billedet nedenfor).

EchiTAbG har vist sig at kunne neutralisere de dødelige effekter af giften fra to øst- og nordøstafrikanske savskællede hugormearter (E. pyramidum leakeyi og E. coloratus) med samme effektivitet som mod giften fra den vestafrikanske tæppehugorm.

Årsagen er, at giften fra disse forskellige slangearter minder tilstrækkeligt meget om hinanden til, at antistofferne genkender toksinerne som værende ens.

Den vestafrikanske tæppehugorm (billedet) er den slange, der dræber flest mennesker i verden hvert år. Det gør den, fordi den som navnet antyder trives med at opholde sig under tæpper i folks huse og ofte bliver overrasket, når den forstyrres. (Foto: Echis ocellatus, Nigeria © David J. Williams (who.int))

Et andet eksempel er modgiften PoliVal-ICP fra Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica, som bliver produceret ved hjælp af giften fra fløjlsgrubeormen (Bothrops asper), den centralamerikanske klapperslange (Crotalus simus) og den centralamerikanske ’bushmaster’ grubeorm (Lachesis stenophrys).

Denne modgift kan krydsreagere med giften fra flere lokale palmegrubeorme (Bothriechis lateralis, B. schlegelii og B. supraciliaris), dog ikke med den sortplettede palmegrubeorm (B. nigroviridis).

Grubeormene er en underfamilie af giftslanger fra hugormefamilien.

I begge disse eksempler er krydsreaktiviteten tilstede inden for den samme familie af slangearter. Det viser, at jo tættere genetisk beslægtede slangearter er, jo større er chancen for, at deres gifte minder om hinanden, og at en modgift mod en arts gift kan krydsreagere med en anden arts gift.

Dog viser eksemplet med modgiften PoliVal-ICP, at krydsreaktivitet inden for den samme artsfamilie ikke er garanteret, da PoliVal-ICP netop ikke virkede mod den sortplettede palmegrubeorm.

I dette tilfælde skyldes det, at den sortplettede palmegrubeorm har ét specifikt type toksin, som ingen af de andre slanger fra undersøgelsen har et ’søstertoksin’, der minder om.

Der er derfor ikke antistoffer mod dette toksin tilstede i modgiften.

Den polyvalente modgift PoliVal-ICP fra Costa Rica kan krydsreagere med giften fra den sidestribede palmegrubeorm (højre), men ikke med giften fra den ellers nært beslægtede sortplettede palmegrubeorm (venstre). Det skyldes ét specifikt toksin, som kun den sortplettede palmegrubeorm har. (Fotos: Bothriechis nigroviridis (venstre) © Tim Vickers (Wikimedia), B. lateralis (højre) © Carlos Luna (flickr))

Krydsreaktivitet er lidt af et lotteri

Så hvorfor er det kun nogle gange, at modgift kan krydsreagere?

Det er utroligt svært at svare på, da vi stadig ved meget lidt om, hvordan krydsreaktivitet fungerer. Hvis en modgift skal virke, skal den kunne neutralisere alle de farligste toksiner, der er i en slanges gift, og det kan være en hel del.

Så hvis en modgift skal virke mod mange forskellige slanger, skal den indeholde utrolig mange forskellige antistoffer. Én type antistof kan nemlig kun genkende et begrænset antal forskellige toksiner.

Tænk på antistofferne som radarlåste missiler.

Hvis et antistof genkender flere forskellige toksiner, betyder det, at toksinerne enten må være tilstrækkelig ens til, at antistofferne genkender toksinerne som de samme, eller også er antistofferne bare langt sejere, end vi troede!

Hvorfor nogle antistoffer virker mod nogle slangetoksiner og ikke mod andre, ved vi også stadig relativt lidt om. Det skyldes blandt andet, at vi ikke har haft metoder, der har kunnet undersøge krydsreaktivitet i dybden indtil for nylig.

Så hvordan finder man ud af, om en modgift er krydsreaktiv?

Oprindelige metoder giver ikke nok svar

Én måde, at teste om modgifte er krydsreaktive, er ved hjælp af dyremodeller, som visualiseret øverst i figur 1 (se nedenfor).

Her sprøjter man gift fra forskellige slanger, som ikke var en del af modgiftsproduktionen ind i mus (step 1), samtidig med at man giver musene den modgift, man gerne vil undersøge krydsreaktiviteten af (step 2).

Hvis musen overlever, virker modgiften, og man har således vist, at modgiften er krydsreaktiv (step 3).

Problemet er bare, at det eneste, man kan undersøge ved denne model, er, om en modgift er krydsreaktiv eller ej. Metoden viser intet om, hvorfor modgiften er krydsreaktiv.

For at spare lidt penge og museliv bruger man også en simpel biokemisk analyse kaldet ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).

Denne metode fortæller, om der er antistoffer i modgiften, som genkender toksiner i slangegiften. Men den viser ikke, om antistofferne rent faktisk neutraliserer toksinerne (figur 1, nederst).

Figur 1: To ældre, men stadig anvendte, metoder, der tester om slangemodgift er krydsreaktivt eller ej. Tallene indikerer de forskellige skridt i processen. Slangemodgiften, man bruger, skal være den, man vil teste krydsreaktiviteten af. Slangegiften kommer fra en slangeart, der ikke er blevet brugt i produktionen af modgiften. (Illustration: Carina Skaarup og Kamille Elvstrøm Krause)

Når antistofferne går i krig

Antistofferne skal kunne binde sig til toksinerne for at kunne neutralisere dem inde i kroppen, men hvis de ikke binder sig tilstrækkeligt stærkt eller til det rigtige sted på toksinet, kan toksinet stadig være skadeligt.

Det svarer til, at man sætter en mundkurv på en glubsk hund for at uskadeliggøre den, men kommer til at sætte mundkurven på halen af hunden i stedet for munden. Så gør mundkurven jo ikke megen gavn, andet end at man sikrer sig, at hunden ikke kan logre, mens den bider løs på én.

Sådan er det også med toksinerne i slangegiften. De har ofte ét specifikt område, der er skyld i, at det enkelte toksin kan gøre skade, ofte kaldet det ’aktive site’ (se historien under artiklen).

Flere muligheder i nye metoder

Nu om dage har en ny teknik til undersøgelse af modgiftes krydsreaktivitet vundet indpas. Denne teknik kaldes ’antivenomics’. Processen er illustreret i figur 3 herunder.

For at forstå ’antivenomics’ er det lettest først at forstå ’venomics’. Venomics er analysen og kortlægningen af alle toksinerne i en slanges gift på et molekylært og kemisk niveau.

I antivenomics går man så baglæns, da man gerne vil undersøge, hvilke af de toksiner, man har kortlagt i venomics-analysen, som antistofferne fra modgiften binder til og dermed uskadeliggør.

Derfor bruger man en teknik til at sortere toksinerne i to grupper; ’dem, der binder’ og ’dem, der ikke binder’. Det gør man ved brug af en speciel type rør, som man fylder med små perler af et geleagtigt stof kaldet agarose (figur 2, step 1).

Tryllebindende agarose perler

Agarose binder ikke til noget i sig selv, men man kan behandle perlerne med en kemisk proces, der gør, at de binder noget helt specifikt – såsom antistofferne fra slangemodgift.

Når man så hælder slangemodgiften ned gennem røret, virker perlerne som små kroge, der fanger antistofferne i modgiften og holder dem fast inde i røret (figur 2, step 2).

Man kan så efterfølgende hælde slangegift ned gennem røret. Nu er det de tilbageholdte antistoffer, der virker som små kroge og fanger slangetoksinerne, som passerer forbi.

• De toksiner, der ikke bliver fanget af antistofferne i røret, bliver skyllet ud i bunden (figur 2, step 3).
• Alle de toksiner, der ikke binder, bliver samlet og analyseret, så man ved, hvilke toksiner det er (figur 2, step 5). Man kan derefter tilføje en væske til røret, der får alle antistofferne til at give slip på de resterende toksiner i kategorien ’binder’.
• Herefter vil alle ’binder-toksinerne’ også blive vasket ud af røret (figur 2, step 4). Disse bliver også analyseret for at bestemme deres identitet (figur 2, step 5). Dermed har man fået sorteret sine toksiner i ’binder’ og ’binder ikke’ til antistofferne i modgiften.

Dette kan man bruge til at vurdere, hvor meget krydsreaktivitet ens modgift udviser mod forskellige slangegifte. Det gøres ved at kigge på, hvor mange forskellige toksiner, der er i ’binder’-gruppen.

Antivenomics metoden viser dog stadig ikke, hvor antistofferne binder på toksinerne på et molekylært niveau – kun hvilke toksiner der bindes et eller andet sted.

Figur 2: En nyere metode til at bestemme tilstedeværelsen af krydsreaktivitet, nemlig antivenomics, som sorterer toksiner i to grupper. Tallene i de grå cirkler indikerer de forskellige skridt i processen. (Illustration: Carina Skaarup og Kamille Elvstrøm Krause)

Der forskes i brugen af bedre fremgangsmåder på DTU

For at komme med et nærmere svar på, hvor ens modgiftsantistoffer binder til et eller flere toksiner, kan man benytte en ny metode kaldet ’high-density peptide microarray'.

Denne teknologi er på Danmarks Tekniske Universitet for første gang blevet brugt til at analysere interaktionen mellem slangegift og -modgift, og processen er illustreret på figur 3.

High-density peptide microarray-metoden bygger oven på en mere generel teknik, som minder om ELISA-metoden.

Når man vil bestemme, hvor på toksinerne i slangegiften, en modgifts antistoffer binder, starter man med at dele alle de relevante toksiner op i små bidder, kaldet peptider, i et dertil designet computerprogram (figur 3, step 1).

Man deler toksinet alle tænkelige steder, hvilket medfører at størstedelen af peptiderne overlapper med hinanden.

Herefter kan man ved hjælp af en maskine sætte peptiderne fast direkte på en glasplade via et slags molekylært anker (figur 3, step 3). Når peptiderne er fastforankret på glaspladen, hælder man sine antistoffer fra slangemodgiften ud over pladen med peptiderne (figur 3, step 4).

De interessante af antistofferne binder sig så fast til nogle af de små peptider, mens de mindre interessante antistoffer ikke binder og vil blive skyllet væk (figur 3, step 5).

Derefter sætter man biokemisk et fluorescerende stof oven på de antistoffer, som har bundet sig til peptiderne ved hjælp af et andet type antistof, som ikke har noget med slangemodgift at gøre (figur 3, step 6).

Så lyser man på sin glasplade og tager et billede af den (figur 3, step 7). På billedet vil man kunne se en masse små lysende pletter, som repræsenterer et peptid med et antistof bundet til sig (figur 3, step 8).

Figur 3 viser processen for high-density peptide microarray, som for første gang blevet brugt til at bestemme tilstedeværelsen af krydsreaktivitet for slangemodgifte. Metoden viser, hvor på toksinerne antistofferne binder. (Illustration: Carina Skaarup og Kamille Elvstrøm Krause)

Man kan dermed sige, at det er lige præcis denne her bid af toksinet, som antistoffet binder sig til. Denne information kan så bruges til videre at finde ud af, om det sted, antistoffet har bundet sig til, er en del af det aktive site (se historien under artiklen), og om antistoffets binding til netop den bid af toksinet kan være med til at gøre toksinet uskadeligt.

Man kan teste krydsreaktiviteten af forskellige modgifte med high-density peptide microarray-metoden ved at finde mønstre i, hvor på toksinerne antistofferne fra de forskellige modgifte binder – og dermed kan man sammenligne modgiftenes bindingsmønstre i molekylære detaljer.

Man kigger altså på, om antistofferne fra forskellige modgifte binder til den samme bid af et enkelt toksin. Hvis de gør det, er der en god chance for, at antistofferne fra modgiftene har den samme neutraliserende effekt mod de samme toksiner.

Hvis det testede toksin ikke kommer fra en af de slangearter, der er blevet brugt i produktionen af modgiften, betyder det endda, at modgiften kan være krydsreaktiv og måske vil kunne bruges til at behandle bid fra andre og flere slanger, end man regnede med.

Fremtidens supermodgift

Hvis man har viden om, hvordan antistoffer og slangetoksiner binder til hinanden, kan man med intelligente metoder optimere modgiftsproduktionen. Man vil for eksempel kunne minimere antallet af slangearter, der skal bruges til at lave en meget bredt virkende modgift.

Informationen om krydsreaktivitet er især også vigtig for de nye metoder, der bliver brugt til at udvikle moderne modgifte.

I disse metoder anvender man humane antistoffer produceret i cellefabrikker i stedet for antistoffer produceret i en hest.

Hvis man kan designe antistofferne og teste dem med high-density peptide microarray- metoden, kan man udvælge de enkelte antistoffer, som er allermest krydsreaktive.

På den måde kan man minimere antallet af antistoffer, man skal finde for at lave en bredspektret modgift. Det gør produktionen lettere og billigere.

Dette vil forhåbentligt være med til at gøre det muligt at producere modgiften med så lave omkostninger, at den kan distribueres i fattige dele af den tropiske verden, hvor der er allermest brug for den!