Annonceinfo

Bag kameraet på en forskningsartikel

Når man læser en forskningsartikel så fremstår den som regel poleret og det virker som om at der ligger en stramt styret og velplanlagt proces bag. Hvis man tæller sammen hvor lang tid det ville tage at lave de enkelte forsøg, kommer man frem til at det da ikke kan have taget særligt lang tid. Processen der ligger bagved er ofte mere rodet og strækker sig gerne over flere år, og ind imellem ender man ikke med det resultat, man regnede med. I denne post vil jeg fortælle om processen bag den seneste artikel jeg har været involveret i.
Det kan ikke helt præcist dateres hvornår ideen til projektet opstod, men et godt bud er nok omkring 2007 hvor jeg skrev speciale. Ideen blev til i diskussioner med min specialevejleder, Michael Ploug fra Finsenlaboratoriet på Rigshospitalet. Jeg havde fornyeligt hørt om en ny teknik ved navn SAXS (mere herom senere), som jeg mente måtte være løsningen på et problem Michaels gruppe havde forsøgt at løse i lang tid. Med erfaring mister man nogle gange også lidt af sin ungdommelige naivitet, og Michael delte ikke helt min optimistiske vurdering af, at alting ville fungere så nemt som der stod i lærebøgerne. Derfor gik der indtil 2009 før det ungdommelige overmod overvandt erfaringens kynisme, og vi kom i gang med projektet. I mellemtiden var jeg blevet Ph.D. studerende på KU og var egentligt ansat til at arbejde på et andet projekt. Da jeg i den forbindelse havde skaffet en tid til at lave SAXS målinger, spurgte jeg Michael, om han ville have nogle prøver med. Jeg mente godt, at jeg kunne have et lille hobbyprojekt ved siden af mit egentlige arbejde, og Michael blev alligevel tilstrækkeligt fristet til at gøre et forsøg. Før vi går i gang med forsøgene er det nødvendigt med lidt baggrund.

Projektet omhandlede et protein ved navn uPAR, der sidder på cellers overflade. uPAR er receptor for et protein-nedbrydende enzym, og medvirker yderligere til at celler sidder fast i deres omgivelser i den såkaldte extra-cellulære matrix. Både nedbrydningen af og adhesionen til omgivelserne er vigtigt i forhold til cellers evne til at sprede sig. Disse processer er specielt vigtige for cancer metastasering, som er processen hvor en svulst danner nye svulster andre steder i kroppen. Hvis ikke cellerne kan nedbryde det “net”, de normalt sidder forankret i, kan de ikke flytte sig til andre steder i kroppen. Pga. uPARs cancer-relevans er man interesseret i at forstå de molekylære detaljer i proteinets funktion. Efter mange års arbejde publicerede Michaels gruppe i 2005 en røntgenkrystal struktur af uPAR, der giver en 3D model af hvordan proteinet ser ud. Snart efter fulgte strukturer hvor uPAR havde bundet sin enzym-partner og et protein fra den ekstracellulære matrix. Disse strukturer afslørede mange detaljer om hvordan proteinet virkede på molekylært niveau, men der var stadig en vigtig del af puslespillet der manglede. I alle disse strukturer var der et andet molekyle bundet til uPAR, og vi vidste derfor ikke hvordan det så ud for sig selv. Når uPAR binder sin enzym-partner inducerer det bindingen til proteinet fra den extracellulære matrix, hvilket muligvis er vigtigt for at koordinere celle adhesion og nedbrydning af omgivelserne. Hvis man låser uPAR fast i den struktur det har i den bundne form, så kan man opnå samme effekt som ved bindingen af enzymet. Dette indikerede, at der sker en strukturændring i uPAR, og at det er den strukturændring, der styrer koordineringen imellem enzymbinding og adhesion til matrixen. For at forstå hvordan denne process foregår, var vi altså nødt til at bestemme strukturen af den ubundne form. Dette havde Michaels gruppe forsøgt på i mange år ved hjælp af røngtenkrystallografi uden held, og derfor var det nødvendigt med en ny eksperimentiel strategi. Det er her SAXS kommer ind i billedet.

SAXS foregår ved at man bestråler sin prøve med en stærk røntgenstråle. Den del af strålingen vil interagere med prøven og blive afbøjet en lille smule. Ved at måle hvor hyppigt strålingen bliver afbøjet i forskellige vinkler kan man få information om molekylernes form. En almindelig “husmands” røngtenstråle er ikke kraftig nok, så derfor laver man typisk SAXS målinger med partikelacceleratorer, i vores tilfælde synkrotronen DESY i Hamborg. Den målestation vi lavede eksperimenterne ved er et EU finansieret projekt, og vi får typisk kun en tid om året. Det var faktisk lige ved at gå galt ved ansøgningen om instrument-tiden, da ansøgningsfristen faldt imens jeg var på ferie. Da vi fik en påmindelsesbesked, så måtte jeg sende fruen på stranden og finde en internet-café, for hurtigt at skrive en ansøgning. Der hersker en lidt speciel stemming på store forskningsfaciliteter sådan som en synkrotron. Når man kun har tid en gang om året vil man have mest muligt ud af den, så alle prøver at køre 24 timer i døgnet. Når man kl. 4 om natten lusker sig ud til cola-automaten efter nyt brændstof, så kan man se folk sidde og arbejde koncentreret ved deres forskellige stationer, imens resten af byen sover. Selvom synkrotronens anlægs- og driftsbudget nok skal måles i milliarder, så er der ikke mange af disse penge, der er gået til arkitekter. Bygningerne ligner rå fabrikshaller, og der er kabler og måleudstyr overalt. Der er ingen grund til at forsøge at gøre det pænt, hvis det betyder at, man bliver nødt til at gemme teknikken væk.

Vores første målinger i 2009 gik ikke så godt. Det viste sig at proteinernes struktur blev ødelagt af et kemikalie vi tilsatte til proteinerne for at beskytte imod skadevirkningerne fra den kraftige røngtenstråling. Hvis vi havde tænkt os lidt om kunne vi nok godt have forudsagt at det kunne ske, så det var med en lidt flov smag i munden, at jeg måtte bede om protein til en ny omgang forsøg. I mellemtiden lavede vi forsøg i laboratoriet i København med andre måder at forhindre røntgenskade på og fandt frem til betingelser, der virkede for uPAR. I 2010 prøvede vi derfor igen, og denne gang fik vi gode data, hvor vi kunne se at der var en klar forskel imellem den frie form og den form der havde enzymet bundet. Vi fik hjælp af en gruppe af eksperter fra Hamborg til at fortolke SAXS dataene. uPAR består af tre beslægtede enheder såkaldte strukturelle domæner, som hver især er omtrentligt kugleformede. I den bundne form danner disse tre domæner en lukket form hvor domæne 1 og domæne 3 næsten rører ved hinanden. Analysen af SAXS dataene viste, at den frie form af uPAR er langt mere åben end de strukturer vi kendte i forvejen, men dog ikke så åben at det ville svare til at alle tre domæner kan bevæge sig frit i forhold til hinanden. Den mest sandsynlige model til at forklare vores SAXS data var derfor at et af domænerne bevæger sig frit i forhold til de to andre. Desværre kunne vi ikke sige om det var domæne 1 eller domæne 3, der var fleksibelt, da disse to tilfælde ville give meget ens data.

Vi ville have en meget bedre historie hvis vi kunne sige hvilket domæne, der var fleksibelt. Derfor kontaktede vi Thomas Jørgensen fra Syddansk Universitet. Thomas’s gruppe er eksperter i en teknik der hedder hydrogen udveksling. I denne teknik udnytter man at visse hydrogen-atomer i proteiner kan udskiftes med andre hydrogen atomer. Ved at bruge den tungere hydrogen-isotop deuterium bliver proteinerne tungere i takt med at hydrogen atomerne udskiftes. Hvor hurtigt et hydrogen atom bliver udskiftet afhænger af proteinets struktur, og strukturændringer som dem vi er interesserede i kan ofte aflæses i hydrogen udvekslingshastighederne. Thomas’s Ph.D.-studerende, Simon Mysling, sammenlignede derfor uPAR i den frie form og bundet til dens enzym ligand. Sammenligningen viste, at den del af domæne 1 der kontakter domæne 2, udveksler hydrogen meget hurtigere i den frie form. Dette viser dermed at det er domæne 1, der er fleksibelt, og yderligere at der sker en delvis udfoldning i domæne 1. At det netop er domæne 1, der ændrer struktur giver meget godt mening, da det protein fra den ekstra cellulære matrix som uPAR binder til, binder netop imellem domæne 1 og 2. Dermed forklarer vores data, hvordan bindingen af enzym liganden styrer bindingen til den ekstracellulære matrix.

Med disse resultater i hånden besluttede vi os for at skrive en artikel sammen. I mellemtiden var jeg flyttet til England, og vores ene samarbejdspartner fra Hamborg var flyttet til Australien. Derfor var det en gruppe forfattere placeret i fire forskellige lande, der skulle skrive en artikel sammen. Mange e-mails med artikeludkast senere havde vi et færdigt manuskript og skulle bestemme, hvilket tidsskrift vi ville sende det til. Vi var selv ret godt tilfredse med vores arbejde og bestemte os derfor for at prøve at sende det til nogle ret selektive tidsskrifter. Det kan være svært at gætte, hvad redaktørerne synes er interessant, og det virker af og til lidt som et lotteri. Vi blev afvist af tre høj impact tidsskrifter uden at artiklen blev sendt til peer review. Denne del af processen kan være meget frustrerende og kan virke som spild af tid, men så længe at forskning i høj grad bliver vurderet på hvor det er publiceret, så er det desværre en nødvendig del af gamet. I fjerde forsøg blev artiklen sendt til Journal of Biological Chemistry, hvor reviewerne kun havde mindre kommentarer og artiklen hurtigt blev accepteret. 5 år efter ideen til projektet blev undfanget er arbejdet derfor nu endeligt offentligt tilgængeligt.

A flexible multidomain structure drives the function of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR). Mertens HD, Kjaergaard M, Mysling S, Gårdsvoll H, Jørgensen TJ, Svergun DI, Ploug M. J Biol Chem. 2012 Aug 15. [Epub ahead of print]

Log ind eller opret konto for at skrive kommentarer

Seneste blogindlæg

Udgiv indhold

Magnus Kjærgaard

Annonceinfo